一年前，我冻存了一些含有10％DMSO和90％FBS的HUVEC(细胞冻存液)。当解冻时，我将其置于水浴中直至大部分解冻，然后将温热的EGM-2加入到冷冻管中，然后转移至含有几毫升温热培养基的15mL Falcon。然后我旋转并重新悬浮并放入涂层的T-25但没有附着细胞。其他人如何冻存和复苏HUVEC？

这是哈哈体育每天在实验室中使用的步骤。哈哈体育使用Frosty先生的冷冻容器在-80°C冰箱中温和冷冻细胞。然后将冷冻的细胞转移到液氮中储存。 

冷冻混合

•热灭活的FCS（哈哈体育使用来自Hyclone的FCS）含有10％DMSO（组织培养级，无菌）。

•在4°C下保持无菌状态。

冷冻

•将Frosty先生的冷冻容器预先冷却至4°C。

•在冰上预冷冷冻介质。每瓶需要~1毫升。

•用HUVEC生长培养基平衡50ml管（HGM：在哈哈体育的情况下，来自Lonza的EGM-2，补充有FCS至18％终浓度FCS）至RT。

•吸出培养基，冲洗1次RT PBS，吸出然后胰蛋白酶消化细胞。确保细胞已分离。

•用HGM中和胰蛋白酶。仔细但完全地重悬细胞。

•将细胞悬浮液转移至15 ml Falcon试管中。

注意：哈哈体育通常会冷冻含有~5 * 10 ^ 5个细胞的小瓶，因此我会在制粒前计算细胞数（为了粗略确定所需的冷冻混合量）细胞冻存液

•离心机中的沉淀细胞（室温下5-7'150 g）。

•吸出培养基并将颗粒放在冰上。

•将冷冻介质加入颗粒中。通过上下移液重新吸取。 

•将细胞悬液分装到冷冻瓶中，然后将瓶子转移到Frosty先生身上。

•将Frosty先生放在-80°C冰箱中，至少保存一夜。

•将冷冻细胞转移到液态N 2或低温生物学设施。

解冻

•准备一个涂有明胶或胶原蛋白的培养瓶。我将含有500K细胞的小瓶放入T75烧瓶（约75cm 2表面）中。

•准备1管12毫升HGM，并在37°C温暖。

• 在37°C的水浴中从液态N 2中解冻1瓶HUVEC 。

•当细胞悬浮液几乎但未完全解冻时，将其与12 ml HGM一起从水浴中取出，并用70％乙醇喷雾小瓶和试管。

•放入组织培养罩并擦去多余的乙醇。

•将样品瓶的内容转移到HGM。

•转移到明胶/胶原蛋白涂层烧瓶中。 

•将烧瓶放入37°C，5％CO 2培养箱中。在一天结束时更换培养基以从冷冻混合物和未附着的细胞（不是很多）中去除DMSO。 细胞冻存液

上述的步骤很繁琐，也很古老

 如果使用HAKATA无血清细胞冻存液，那么你只需要将冻存液从4°C冰箱中取出来使用，

冻存管直接放于-80°C过夜，在转移只液氮中就可以了。