种属

人

细胞来源

上海市东方医院

生长特性

贴壁 球形克隆

培养条件

培养基：STEMCELL的mTSR1，人胚胎干细胞无饲养层培养基

温度：37℃     气相：95%空气,5% CO2

传代

1.用75%酒精喷洒整个培养瓶消毒，将其平躺置于培养箱中进行1-3小时的缓冲，.然后置于无菌操作台，打开瓶口，将其中的培养液去掉，再往其中加入5-6mL新鲜培养基(以T25培养瓶为例)并置于细胞培养箱中培养，根据细胞生长状况及培养基颜色变化对其进行换液以及传代，每次传代48h后一天换一次；

2.待细胞克隆还没开始融合时，需要对其进行传代，传代比例为1:4；

3传代步骤：将1 mg/mL胶原酶IV消化液置于37°预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5 ml PBS，轻晃洗涤后弃去。往瓶中加2 ml预热好的胶原酶，置于37°孵育消化（第一次消化需时常取出置于显微镜下观察，以显微镜下细胞触角回收变圆、轻拍瓶壁见细胞脱落为最佳消化时间，记录最佳消化时间，以便于下次消化，前30min观察一次，之后每15min观察一次）一般孵育30-60min左右，消化好后加入5ml完全培养基。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液，置于15ml离心管中，待细胞自然沉降后将上层Collagenase-type IV吸除，加入hES完全培养液5 ml，吹打2-3次，待细胞自然沉降后将上层培养液吸除。再加入培养液重悬细胞传代。每次传代后48h内不要移动。

保存

冻存条件：60%完全培养基+30%FBS（ES级）+10%DMSO

(备注：建议使用本公司的冷冻液（H-W-100），用4度保存的冷冻液直接重悬细胞，不能预热后使用。)

保存条件：液氮存储

供应限制

仅供研究之用

常见问题及解决方案

1.培养瓶有破裂，培养液有漏液：细胞极大可能会污染，所以哈哈体育会及时安排帮老师解决。

2.细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。1-2小时后观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞活力正常，剩余漂浮的细胞可以去掉，留8-10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，哈哈体育的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。